本发明公开了一种双水相体系及其分离西瓜果肉中维生素B6的应用，包括氯化-N-丁基吡啶离子液体、磷酸二氢钾和水，按质量百分比计，双水相体系中氯化-N-丁基吡啶离子液体为50%～70.1%，磷酸二氢钾为15.3%～24.2%，其余组分为水，三组分的总质量分数为100%。该方法对维生素B6的萃取率可达98.9%。具有线性范围宽，检出限低，相对标准偏差较小，对样品的测定回收率高，萃取效果良好等特点。可为生物医药等多个领域提供大量，高纯度的维生素B6。